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　　酵母双杂交作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。

　　酵母双杂交系统是建立在人们对酵母转录因子GAL4的认识基础上的。一个完整的酵母转录因子GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域（DNA-BD）和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因的上游激活序列(UAS)并与之结合，而AD则是通过与转录机构中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。研究人员发现DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上极为接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。根据这一特性，后期实验人员开发了两种质粒，一种是BD质粒（含有GAL4的DNA结合域），另一种是AD质粒（含有GAL4的转录激活域）。如需验证蛋白之间的相互作用，只需要将2种蛋白质（X/Y蛋白）分别构建出BD-X质粒载体和AD-Y质粒载体，将2个重组质粒载体共转化至酵母体内表达。判断通过报告基因表达与否，即可判断两蛋白之间是否存在相互作用。

　　赤霉病（FHB）是世界范围内的毁灭性小麦疾病。而与小麦FHB抗性相关的是Fhb1上的成孔毒素（PFT）基因。在这项研究中，使用从小麦赤霉病菌感染的苏麦3号小麦穗中提取的RNA构建了高质量酵母双杂交文库。PFT的凝集素结构域对酵母细胞没有自激活和毒性，因此被用作诱饵来筛选Y2H文库。通过筛库获得了与PFT相互作用的23种蛋白质，这些蛋白质主要参与泛素化过程，网格蛋白涂层组装，氧化还原过程和蛋白质磷酸化。这些相互作用基因的表达模式通过实时定量PCR进行了验证。这项研究阐明了PFT的蛋白质相互作用，并提出了有关小麦FHB抗性的PFT调控网络。

　　高度抗FHB的苏麦3号（培育条件：光照时间14h，室温24℃；黑暗时间10h，室温15℃。收集样品立即在液氮中冷冻，然后保存在-80°C直至进一步使用。）

　　酵母生长性能的评估：PFT包含两个结构域，一个是两个凝集素结构域。另一个是ETX/MTX2蛋白结构域（图A）。ETX/MTX2蛋白是有效的毒素，对活细胞构成潜在威胁。将全长PFT及其两个结构域分别转化到Y2HGold酵母菌株中，然后接种在缺乏亮氨酸（SD/-Leu）培养基上，仅含有凝集素的酵母细胞的生长域没有被感染，但是与空载体对照相比，ETX/MTX2毒素的表达对酵母菌的生长有毒性作用（图B）。

　　诱饵自激活的检测：将载体pGBKT7，pCL1和pGBKT7-PFTa转化到Y190酵母菌株中，然后将所得转化体接种在带色氨酸且含有酵母半乳糖苷酶发色底物（SD/-Leu）的SD培养基上。阳性对照pCL1菌落在SD/-Leu/X-α-Gal平板上变为蓝色（图2B），但与阴性对照一样，pGBKT7-PFTa菌落也未变为蓝色（图2A，C），表明诱饵pGBKT7-PFTa在没有猎物蛋白的情况下不能自主激活报告基因，因此它适合用来构建酵母文库。

　　酵母文库的构建：提取小麦穗的总RNA，并质检总RNA是否完整、有无降解（图3A）。为了获得用于后续文库构建的高质量cDNA，使用SMART技术（Clontech）合成了cDNA，并在1％琼脂糖凝胶上通过电泳进行质检分析（图3B），使用Chroma Spin-1000色谱柱纯化消除小cDNA片段（图3C），然后转移至pGADT7载体以构建酵母双杂文库。为了确定cDNA文库插入片段的长度，随机选择了16个阳性克隆，并通过PCR扩增鉴定。结果表明插入的片段大小在0.5到2.25 kb之间（图3D），Y2H库可用于进一步研究。

　　PFT相互作用蛋白的筛选：将含有AD文库和pGBKT7-PFTa的Y190酵母细胞涂布到缺陷型平板上进行第一次筛选，总共生长了212个克隆，分离并测序所有质粒的插入片段，鉴定出57个不同的基因。由于存在假阳性克隆，我们将质粒pGBKT7-PFTa和代表不同基因的57个质粒分别转化到Y2HGold酵母细胞中。Y2HGold菌株由于自身无法合成His和Ade，所以无法在缺少两种必需氨基酸的培养基上生长。当诱饵和猎物蛋白相互作用时，GAL4响应并诱导His3和Ade2基因进行表达，使细胞能够生物合成这两个氨基酸，并在–His–Ade基本培养基上生长。最后，通过筛选鉴定了代表不同基因的23个阳性克隆（图4），并使用NCBI数据库和UniProt数据库对克隆测序结果进行比对分析，这样可获得具体对应的蛋白类型。

　　在本研究中，鉴定出了23种与PFT相互作用的蛋白。其中5种蛋白质出现频率最高，出现118次，覆盖212个克隆的55.6％。这5种蛋白带有的部分结构域在植物生长和发育的各个过程中以及在抵抗生物和非生物胁迫方面具有关键作用。基于这些发现，可以利用PFT及其相互作用蛋白构建小麦抗赤霉病入侵的调控网络。